大农化网报道：近日，西北农林科技大学草业与草原学院杨培志教授团队在The Plant Journal发表题为″An efficient gene delivery method utilizing the regenerative capacity of alfalfa (Medicago sativa)″的研究论文。该研究利用多年生紫花苜蓿自身强大的分生组织再生潜能，成功建立了一套绕过愈伤组织诱导阶段，直接基于幼苗茎尖和成熟茎段再生的高效遗传转化与CRISPR/Cas9基因编辑技术体系，为多年生豆科牧草功能基因组学解析和分子设计育种提供了高效、实用的技术平台。
优质饲草紫花苜蓿（Medicago sativa）在草牧业生产中具有重要作用，是世界范围内最重要的优质豆科牧草之一。作为同源四倍体、异花授粉的多年生植物，紫花苜蓿传统的遗传转化方法高度依赖叶片诱导愈伤组织的体细胞胚发生途径。这一过程不仅操作繁琐、再生周期长，且转化效率低、品种（基因型）依赖性强，长期制约着紫花苜蓿的生物技术改良进程。
图1 紫花苜蓿茎尖遗传转化体系流程及EGFP（增强型绿色荧光蛋白）、RUBY（甜菜色素可视化报告系统）可视化转化筛选表型
研究团队以幼苗茎尖和带腋芽的成熟茎段为材料，结合农杆菌介导的真空浸润与筛选，建立了两条互补的遗传转化途径。该体系利用紫花苜蓿茎分生组织直接再生植株，避开了愈伤组织诱导环节。其中，茎尖途径约2个月即可获得稳定转基因植株；成熟茎段途径则结合扦插繁殖，4个月实现成株材料的遗传转化与基因编辑。在基因编辑验证中，团队成功获得了MsPDS（八氢番茄红素脱氢酶）、MsSIG6（质体sigma因子6）、MsDG1（延迟变绿1）和MsBRI1（油菜素内酯不敏感蛋白1）等基因的编辑植株，并观察到相应的白化、黄化、矮化及叶片发育异常等表型。以MsPDS为靶标的3次独立试验中，编辑植株占再生植株的比例为22.1%—43.8%，并获得四个等位拷贝均发生编辑的植株。该体系在多个紫花苜蓿品种中得到验证，Southern杂交和连续扦插后的分子检测进一步支持外源基因的稳定整合及其在无性繁殖材料中的保留。
图2 紫花苜蓿茎段遗传转化体系流程
该研究打破了品种（基因型）依赖性，将紫花苜蓿的再生特性与遗传转化相结合，简化了转基因和基因编辑材料的创制流程，为抗逆、产量和品质等相关基因的功能验证及以优良种质创制提供了技术支撑，也为其他具有较强再生能力的植物开展遗传转化提供了参考。
论文链接：https://doi.org/10.1111/tpj.71195
