近日，西北农林科技大学刘西莉课题组在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上发表了题为“Computationally and target-guided discovery of trifluoromethyl-pyrazole derivatives targeting the a–c subunit interface of V-ATPase in Phytophthora capsici”的研究论文。该研究通过计算模拟，首次明确氟吡菌胺结合于V-ATPase的a–c亚基功能界面，并基于此将药物设计策略从靶向单个a亚基拓展至a–c互作界面。通过虚拟筛选与结构优化，研究团队发现了一类结构新颖的三氟甲基吡唑衍生物——化合物4j，为靶向V-ATPase的绿色杀菌剂创制提供了全新先导。
液泡型ATP酶（V-ATPase）是一种异源多亚基质子泵，在细胞的液泡酸化、离子稳态及生长发育过程中发挥关键作用。此前，本课题组已率先揭示了苯甲酰胺类杀菌剂——氟吡菌胺和氟醚菌酰胺的作用靶标为V-ATPase的a亚基，并解析了其关键结合位点。本研究进一步采用分子动力学模拟，对氟吡菌胺与辣椒疫霉PcV-ATPase的结合模式进行了系统解析。通过对7个代表性对接构象分别进行100 ns MD模拟及MM/PBSA自由能计算，发现构象d具有最低的结合自由能，被确定为稳定结合模式。能量分解分析发现，氟吡菌胺同时与a亚基的Asn771、Gly767、Ser770以及c亚基的Ile60等残基相互作用，证实其结合位点位于a–c亚基互作界面（图1）。
图1 分子动力学模拟揭示氟吡菌胺结合于PcV-ATPase蛋白a–c亚基界面
（A：RMSD；B：结合自由能；C：氨基酸自由能；D：分解自由能；E：结合模式）
基于该界面结构，研究团队通过类农药规则过滤及分级分子对接（HTVS→SP→XP→MM/GBSA），从80余万化合物中筛选出先导化合物a10。通过将苯氧基片段替换为三氟甲基吡唑骨架，获得系列衍生物，其中化合物4j对辣椒疫霉菌丝生长的EC50为8.45μg/mL。生化试验表明，20μg/mL化合物4j对PcV-ATPase酶活的抑制率为57.72%，证实其可有效干扰V-ATPase的质子转运功能。敏感性测定显示，4j对含有G767R和N771Y点突变的氟吡菌胺高抗突变体仍保持良好抑菌活性，但对含有N846S和K847R点突变的突变体抑菌活性下降，提示4j与氟吡菌胺的结合模式虽存在部分重叠，但仍具有差异（图2）。
图2 虚拟筛选及结构优化发现化合物4j及其作用机制
（A：虚拟筛选；B：结构优化；C：V-ATPase酶活；D：突变体敏感性）
进一步研究发现，20μg/mL化合物4j显著抑制辣椒疫霉孢子囊形成、游动孢子释放及休止孢萌发，其中，对孢子囊形成的抑制活性最好。在离体烟草叶片试验中，4j在200μg/mL浓度下展现出显著的保护活性（图3）。
图3 化合物4j抑制辣椒疫霉无性繁殖不同阶段及其离体保护活性
（A：孢子囊形成；B：游动孢子释放；C：休止孢萌发；D：离体保护活性）
本研究首先通过计算模拟揭示了氟吡菌胺结合于V-ATPase的a–c亚基界面，进而基于该界面的三维结构开展了虚拟筛选与骨架优化，获得了结构新颖的三氟甲基吡唑类抑制剂4j。该化合物与已知氟吡菌胺类结构迥异，具备突破交互抗性的潜力，为靶向V-ATPase的新型卵菌抑制剂的创制提供了重要先导和理论依据。
西北农林科技大学植物保护学院博士后路星星为论文第一作者，刘西莉教授和苗建强研究员为论文通讯作者，代探副教授、博士研究生袁康、王妍以及硕士研究生王惜惜、李欣欣也参与该项工作。该研究得到了国家自然科学基金（31730075）、中国博士后科学基金（2024M762650）及陕西省博士后基金（2025BSHDZZ164）的资助。
原文链接： https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.6c02464。
