原标题：Metcyclofenstrobin的合成及抗真菌活性
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类作用机制独特、发展潜力巨大且市场前景广阔的农用杀菌剂。该类杀菌剂首次上市于1996年，至今已有多个品种实现商品化。其主要通过与真菌线粒体中的bc1细胞色素酶复合物结合，抑制真菌呼吸作用，从而有效抑制病原真菌的生长。目前，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂已广泛应用于作物杀菌领域，典型代表包括嘧菌酯、烯肟菌酯和啶氧菌酯等，已在农药杀菌剂市场中占据重要地位。
Metcyclofenstrobin化学名称为甲基(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-甲氧基丙-2-烯酸酯，是一种新型甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其分子结构见图1。相比传统甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，metcyclofenstrobin对部分抗药性病原菌表现出良好的活性。
图1 Metcyclofenstrobin化学结构式
本研究通过文献调研和实验探索，对现有合成路线进行改进，以更高的收率成功制备了目标杀菌剂metcyclofenstrobin。并系统评估了其对黄瓜霜霉病、黄瓜炭疽病、小麦白粉病、大豆锈病、小麦锈病、水稻稻瘟病及大豆灰霉病的防治效果。该研究为metcyclofenstrobin在农业真菌病害防治中的应用提供了理论依据，也为新型杀菌剂的开发提供了重要参考。
1 实验部分
1.1 材料与仪器
5-溴-2-甲基苯酚、溴乙酸甲酯、甲酸甲酯、硫酸二甲酯、四丁基溴化铵，分析纯，上海毕得医药科技股份有限公司；环己烯-1-基硼酸、碳载钯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]钯(II)，分析纯，上海麦克林生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、石油醚，分析纯，沈阳新化试剂厂；甲苯、甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚、乙腈，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；磷酸钾、氢化钠、碳酸钾、碳酸氢钠、氯化钠、硫酸镁，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
AVANCE III 600MHz核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司；Accurate-MassQ-TOF LC/MS型质谱仪，美国Agilent公司；CHEETAH中压快速纯化制备色谱，天津博纳艾杰尔科技有限公司；R-300旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司。
1.2 化合物的合成
现有文献报道了先行制备甲氧基丙烯酸酯中间体后进行偶联引入环己基的反应路线，综合收率为32.4%。本实验在此基础上，开发了先进行偶联后引入甲氧基丙烯酸酯结构的新合成路线，即5-溴-2-甲基苯酚先与环己烯-1-基硼酸经suzuki偶联反应制得5-(环己烯-1-基)-2-甲基苯酚中间体，然后分别与溴乙酸甲酯、甲酸甲酯及硫酸二甲酯发生取代、缩合和甲基化反应，制备metcyclofenstrobin（见图2）。反应总收率可达46.8%（以5-溴-2-甲基苯酚计）。该路线将5-溴-2-甲基苯酚与环己烯-1-基硼酸直接偶联，反应更易进行，收率相应提高，有效避免了原工艺中对关键中间体的损耗。整个过程所使用原料和试剂均易获得，成本可控。各步反应条件温和，无需加压或密封操作，反应时间均在3 h以内，且后处理方法简便易行。
图2 Metcyclofenstrobin的合成路线
1.2.1 中间体5-(环己烯-1-基)-2-甲基苯酚的合成
向100 mL单口瓶中依次加入5-溴-2-甲基苯酚（1.86 g，0.01 mol）、环己烯-1-基硼酸（1.89 g，0.015 mol）、PdCl2（dppf）（0.1 mmol，0.07 g）、磷酸钾（4.24 g，0.02 mol）、乙腈（15 mL）和水（4 mL）。氮气环境下，搅拌升温至70℃并保温3 h。薄层色谱监测原料已完全反应，冷却至室温。反应体系用EtOAc稀释，并依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥、过滤，滤液浓缩，得到无色油状化合物5-(环己烯-1-基)-2-甲基苯酚（1.42 g，7.55 mmol），收率75.5%。1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：7.05（dq，J=8.4，1.0 Hz，1H），6.92（dd，J=8.4，2.2 Hz，1H），6.83～6.81（m，2H），6.15（tt，J=5.1，1.1 Hz，1H），2.87～2.79（m，1H），2.54～2.46（m，1H），2.24（d，J=1.0 Hz，3H），2.03（qtd，J=4.6，3.5，2.6 Hz，2H），1.64～1.54（m，4H）。ESI-MS(m/z)：[M+H]+ 理论值189.12，测试值189.19。
1.2.2 中间体5-环己基-2-甲基苯酚的合成
向100 mL单口瓶中依次加入5-(环己烯-1-基)-2-甲基苯酚（1.88 g，0.01 mol）、碳载钯（5%，0.18 g，0.08 mmol）和无水甲醇（10 mL）。在氢气环境下搅拌升温至50℃并保温2 h。薄层色谱监测原料已完全反应，冷却至室温。反应体系经过滤、滤液浓缩，得到无色油状化合物5-环己基-2-甲基苯酚（1.79 g，9.42 mmol），收率94.2%。1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：7.05（dq，J=8.4，1.0 Hz，1H），6.74（ddd，J=8.4，2.3，1.0 Hz，1H），6.67（s，1H），6.63（dd，J=2.2，1.0 Hz，1H），2.56（pt，J=5.8，1.1 Hz，1H），2.23（d，J=1.0 Hz，3H），1.90～1.75（m，4H），1.71～1.61（m，1H），1.51～1.39（m，4H），1.32（dtt，J=12.7，7.5，5.1 Hz，1H）。ESI-MS(m/z)：[M+H]+ 理论值191.14，测试值191.33。
1.2.3 中间体2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)乙酸甲酯的合成
向100 mL单口瓶中依次加入5-环己基-2-甲基苯酚（3.80 g，0.02 mol）、溴乙酸甲酯（4.56 g，0.03 mol）、碳酸钾（2.07 g，0.03 mol）及乙腈（25 mL）。反应体系搅拌升温至45℃并保温2 h。薄层色谱监测原料已完全反应，冷却至室温。过滤，滤液浓缩后用EtOAc稀释，并依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥、过滤，滤液经旋蒸得到无色油状液体2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)乙酸甲酯（4.82 g，0.018 mol），收率91.9%。1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：7.12（dq，J=8.4，1.0 Hz，1H），6.83（ddd，J=8.4，2.0，1.1 Hz，1H），6.77（dd，J=2.1，1.1 Hz，1H），4.68（s，2H），3.75（s，3H），2.59（pt，J=5.8，1.1 Hz，1H），2.20（d，J=0.9 Hz，3H），1.78～1.67（m，4H），1.65～1.57（m，1H），1.55～1.43（m，4H），1.39～1.31（m，1H）。ESI-MS(m/z)：[M+H]+ 理论值263.16，测试值263.01。
1.2.4 中间体(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-羟基丙烯酸甲酯的合成
向100 mL单口瓶中依次加入2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)乙酸甲酯（5.24 g，0.02 mol）、甲酸甲酯（2.40 g，0.04 mol）、氢化钠（2.00 g，60%，0.05 mol）及甲基叔丁基醚（25 mL）。反应体系搅拌升温至40℃并保温2 h。薄层色谱监测原料已完全反应，冷却至室温。过滤，滤液依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥、过滤，滤液经旋蒸得到白色固体(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-羟基丙烯酸甲酯（5.04 g，0.017 mol），收率86.8%，熔点72.8～74.2℃。1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：8.37（d，J=5.7 Hz，1H），7.16（d，J=5.7 Hz，1H），7.08（dq，J=8.4，1.0 Hz，1H），6.82（ddd，J=8.4，2.0，0.9 Hz，1H），6.74（dd，J=2.0，0.9 Hz，1H），3.83（s，3H），2.54（pt，J=5.7，0.9 Hz，1H），2.21（d，J=1.0 Hz，3H），1.89～1.82（m，2H），1.75（dtt，J=12.6，7.5，5.1 Hz，2H），1.69～1.60（m，1H），1.53～1.42（m，4H），1.37～1.29（m，1H）。ESI-MS(m/z)：[M+H]+ 理论值291.15，测试值291.47。
1.2.5 目标化合物甲基(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-甲氧基丙-2-烯酸酯的合成
向25 mL单口瓶中依次加入(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-羟基丙烯酸甲酯（5.00 g，0.017 mmol）、四丁基溴化铵（0.55 g，1.72 mmol）、硫酸二甲酯（3.28 g，0.026 mol）和甲苯（15 mL）。反应体系搅拌升温至70℃并保温3 h。薄层色谱监测原料已完全反应，冷却至室温。反应体系用EtOAc稀释，并依次用饱和NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥、过滤，滤液经旋蒸得到白色固体目标化合物甲基(Z)-2-(5-环己基-2-甲基苯氧基)-3-甲氧基丙-2-烯酸酯（4.26 g，0.014 mol），收率82.4%，熔点131～132℃。1H NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：7.09（dq，J=8.4，1.0 Hz，1H），6.85（ddd，J=8.4，1.9，1.0 Hz，1H），6.76（dd，J=2.0，1.0 Hz，1H），6.08（s，1H），3.83（s，3H），3.64（s，3H），2.56（pt，J=5.7，1.0 Hz，1H），2.19（d，J=0.9 Hz，3H），1.89～1.81(m，2H)，1.76（dtt，J=12.5，7.5，5.0 Hz，2H），1.68～1.60（m，1H），1.53～1.42（m，4H），1.37～1.29（m，1H）。ESI-MS(m/z)：[M+H]+ 理论值305.39，测试值305.17。
1.3 生物活性测试
称取metcyclofenstrobin 0.0088 g并溶解到2 mL丙酮中，加入含0.1%吐温80的水，配制成400 mg/L的药液20 mL，另称取对照药剂代森锰锌、烯肟菌胺、嘧菌酯，配制成25 mg/L的药液20 mL。采用活体盆栽法进行生物活性测定，喷雾施药到植物试材上，自然风干，24 h后进行病原菌接种。接种后，将植物放在人工气候室中培养，24 h后将植物试材移入温室培养，待对照充分发病后进行化合物杀菌效果评估。
2 结果与讨论
化合物metcyclofenstrobin对7种供试靶标的杀菌活性测定结果（见表1）表明：metcyclofenstrobin对小麦锈病具有显著的防治活性，在低测试质量浓度6.25 mg/L时，其防治效果可达到100%。对于水稻稻瘟病，metcyclofenstrobin在最高质量浓度100 mg/L时防治效果达到98%，但随着质量浓度下降，防治效果有所减弱。相比之下，metcyclofenstrobin对黄瓜炭疽病和大豆灰霉病亦有一定的防治效果，在最高质量浓度100 mg/L时分别达到75%和85%。对黄瓜霜霉病、小麦白粉病及大豆锈病的防治效果较差，在测试质量浓度下均表现出较低的防治活性。
对比杀菌剂metcyclofenstrobin与bifemetstrobin对供试靶标抗真菌活性的表现可知：1) metcyclofenstrobin对大豆灰霉病和水稻稻瘟病的防效较bifemetstrobin突出，在最高质量浓度100 mg/L时防治效果分别达到85%和98%，而bifemetstrobin仅对水稻稻瘟病在最高质量浓度100 mg/L时防治效果达到90%；2) metcyclofenstrobin对小麦白粉病的防治效果弱于bifemetstrobin，在所有质量浓度下均为0，bifemetstrobin在最高质量浓度100 mg/L时对黄瓜炭疽病防治效果优于metcyclofenstrobin，达到100%；3) 二者对小麦锈病防治效果均较强，对黄瓜霜霉病均较弱。
总体来看，metcyclofenstrobin表现出较广谱的抗真菌活性，特别是在小麦锈病和水稻稻瘟病的防治上效果突出，但其对某些病害及作物安全性仍需进一步关注。
表1 Metcyclofenstrobin及对照药剂的杀菌活性
3 结论
以5-溴-2-甲基苯酚、环己烯-1-基硼酸、溴乙酸甲酯、甲酸甲酯及硫酸二甲酯为原料，成功合成了化合物metcyclofenstrobin，其结构通过1H NMR和ESI-MS确证。实验结果总结如下：
1) 采用先偶联后醚化的新合成路线，经5步反应制得化合物metcyclofenstrobin。反应条件温和，后处理操作简便，有效避免了原工艺中对关键中间体的损耗，综合收率可提高至46.8%。
2) 室内盆栽抗真菌活性测试显示，metcyclofenstrobin在测试质量浓度下对多种植物病害具有显著防治效果。对小麦锈病，在低质量浓度6.25 mg/L时即达到100%的防治效果；对水稻稻瘟病，在高质量浓度100 mg/L时防治效果达到98%，质量浓度降低至0.39 mg/L，仍可保持50%的防治效果；对黄瓜炭疽病和大豆灰霉病，高质量浓度100 mg/L时有一定的防治效果，但随质量浓度降低，防治效果明显下降；黄瓜霜霉病、小麦白粉病及大豆锈病的防治效果则相对较弱，在最高质量浓度100 mg/L下防治率仍接近0%。
3) Metcyclofenstrobin与杀菌剂bifemetstrobin在结构上类似，有文献报道，bifemetstrobin采用先酯化后偶联的合成路线，二者的反应条件均较温和，综合收率皆可达40%以上。在杀菌活性方面，metcyclofenstrobin对大豆灰霉病和水稻稻瘟病的防治较bifemetstrobin突出，对小麦白粉病的防效弱于bifemetstrobin。二者对黄瓜霜霉病防治效果均较弱，对小麦锈病均展现出较高的防治效果，在最低测试剂量0.39 mg/L下仍不低于70%。
综上所述，metcyclofenstrobin展现出优异、广谱的抗真菌活性，具备较大的应用潜力，为农业真菌病害防治研究提供了新的思路和方向。
