基于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的RNA农药，也称核酸农药或核酸干扰素，是一种干扰目标生物特定基因转录的多核苷酸制剂，利用RNAi技术靶向有害生物的关键基因，影响有害生物的生长发育，实现病虫害防治的目的。RNA干扰是近年来最重要的生物学发现之一，位列2002年《Science》期刊公布的“十大科学突破”之首，其发现者获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。RNA杀虫剂的田间应用被评为2024年《Science》期刊“十大科学突破”之一。RNA干扰是指双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引起靶标信使RNA（mRNA）特异性降解的现象。其包括4个基本过程。（1）小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）生成：dsRNA被Dicer酶切割成短的siRNA。（2）RNA诱导沉默复合体RISC组装：siRNA与Argonaute（AGO）蛋白以及其他辅助因子结合，形成活跃的RISC复合体。（3）靶基因识别与沉默：RISC复合体通过siRNA的序列特异性与靶mRNA结合，导致靶mRNA的降解，抑制目标基因的表达。（4）信号的放大：siRNA在RNA聚合酶作用下延伸，然后被Dicer酶切割形成新的siRNA，实现基因干扰的放大作用。RNA农药是一种新型生物农药，被誉为农药史上的第3次革命。与传统化学农药相比，RNA农药具有很多优点。（1）安全性：被誉为有史以来最安全的农药，由于靶标基因及其序列的高度特异，RNA农药通常不会对非靶生物造成负面影响。（2）环境友好性：喷洒型RNA农药不会在土壤、水体或空气中长期残留，不会对生态系统造成持续污染，快速降解、无残留和污染。（3）普适性：理论上，RNA农药能针对所有的真核有害生物研发产品。（4）研发周期：RNA农药的研发周期较短，美国传统化学农药进入市场至少需12年，RNA农药从确定靶标序列、合成到田间试验，通常只需要4年，喷洒型RNA农药最快为3～6个月。基于RNAi技术创制的RNA农药具有众多优势，在病虫害防治领域表现出巨大潜力。
RNA农药作为潜在的新型绿色植保产品，开发和应用尚处于起步阶段，仍然面临许多挑战。本文将从RNAi技术防治病虫害的应用现状、RNA农药创制的瓶颈问题与解决办法、RNA农药在未来植保领域的发展趋势进行综述，旨在加深对RNA农药产品的认识，为今后RNA农药的开发与推广提供参考。
1 RNAi在病虫害防治领域的应用现状
1.1 实现基因干扰的RNA及其作用机制
能够触发RNA干扰的RNA分子包括siRNA、dsRNA、发夹RNA（hairpin RNA，hpRNA）、短发夹RNA（short-hairpin RNA，shRNA）以及微小RNA（microRNA，miRNA）等。
1.1.1 siRNA
siRNA是一类21～23核苷酸（nt）的双链RNA分子，双链两端通常具有2个核苷酸的3’突出。siRNA的特点是见效快，能在短期内高效触发基因干扰。例如，siRNA注入家蚕（Bombyx mori）卵内可有效沉默目标基因，注射Ubx-siRNA的胚胎有90%在幼虫期观察到腹部第1节长出额外的足，而注射dsRNA的胚胎只有14%在幼虫期观察到这一表型。dsRNA和siRNA在西方蜜蜂（Apis mellifera）中都成功实现酪胺受体tyr1基因敲低，但是siRNA比dsRNA更快影响tyr1表达。
基因干扰的理想靶点是在病原物或害虫中存在，但在有益生物中不保守的基因。siRNA长度短，相比于长链RNA分子可能存在的脱靶风险，siRNA更有利于设计靶向目标生物而不靶向人类和非靶标生物的基因序列。siRNA干扰棉铃虫（Helicoverpa armigera）乙酰胆碱酯酶基因acetylcholinesterase（AChE）造成幼虫死亡，这种基因沉默具有特异性，没有脱靶效应。但是，也有研究表明，RNA分子被昆虫细胞吸收的效率与长度有关，在马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）β-actin中长链RNA分子吸收效率更高，而siRNA较低。在沙漠蝗（Schistocerca gregaria）体内注射alpha-tubulin 1a siRNA，与注射dsRNA相比，siRNA并不能触发RNAi。因此，siRNA干扰效果可能受物种、基因片段和递送效率等多因素影响，系统性地对比各种类型的RNA片段在细胞摄取、组织传输、RNAi效率、表型等方面的特征，有利于优化RNA农药的合成策略。
1.1.2 dsRNA
dsRNA是目前病虫害防治中应用最广泛的RNA分子，长度为100～500 bp，由配对的反义（antisense）和正义（sense）链组成。dsRNA的应用方式主要有转基因植物表达、转基因病毒等微生物表达、大肠杆菌生物发酵表达、非细胞体系合成等。例如，表达大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）VdH1 dsRNA的转基因棉花能够阻碍真菌繁殖，提高对大丽轮枝菌的抗性。表达马铃薯甲虫β-actin dsRNA的马铃薯能够完全防治马铃薯甲虫，且dsRNA在植物中长期存在，持续提供保护。重组Sindbis病毒介导的RNA干扰家蚕Broad-Complex基因能造成家蚕化蛹异常，成虫形态缺陷。烟草上施用烟草花叶病毒（TMV）p126和CP dsRNA可显著抵抗TMV感染。叶面喷洒亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）β2-tubulin dsRNA能够抑制镰刀菌的生长。靶向柑橘木虱（Diaphorinacitri Kuwayama）Arginine Kinase dsRNA喷洒在柑橘上能导致柑橘木虱大量死亡。生化合成的dsRNA喷洒于植物表面，可避免转基因技术带来的公众担忧和监管审批等问题。因此，喷洒型dsRNA产品是未来的主流发展方向。
1.1.3 hpRNA
在hpRNA出现之前，dsRNA主要采用T7 RNA聚合酶以cDNA为模板在体外双向转录合成，这种体外系统成本较高，不适合大规模生产。hpRNA是由一段单链RNA通过自身折叠形成，其中一部分序列与其互补序列配对，形成双链区域，即茎（stem）部分，而未配对的部分形成环（loop）结构。与dsRNA相比，茎环结构可以在高温、强酸和强碱等条件下维持，具有较高的稳定性。hpRNA在生物细胞内同样可以被Dicer酶识别并切割，产生siRNA，实现高效的基因干扰。植物中表达具有70 nt环和约500 bp茎发夹结构的hpRNA，靶向辣椒疫霉PcCesA3和PcOSBP1，能显著提高烟草对辣椒疫霉的抗病性；在棉花中表达棉铃虫CYP6AE14的hpRNA，能大大降低棉铃虫幼虫对棉酚的耐受性，降低存活率。hpRNA能在微生物表达系统表达，对有害生物外源应用，便于大规模生产，对田间应用具有重要意义。例如，在大肠杆菌（Escherichia coli）内表达甘蔗花叶病毒（SCMV）衣壳蛋白（Coat protein）基因CP1和CP2 hpRNA，菌液喷洒在植物表面能有效抑制SCMV感染。大肠杆菌hpRNA表达系统在多种害虫的基因干扰中成功应用，包括东方粘虫（Mythimna separata）、马铃薯甲虫、桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）、桃蚜（Myzus persicae）等。这一技术的建立有望提高RNA合成效率，降低RNA的合成成本，满足田间生产的实际需求。
1.1.4 shRNA
shRNA是通过一个回文序列形成发夹（茎环）结构的短RNA。茎区由配对的反义和正义链组成，环区由未配对的核苷酸组成，长度通常小于100个核苷酸。shRNA可以利用质粒或病毒载体转入生物细胞表达。在目标生物细胞内，Dicer酶把shRNA切割成siRNA触发RNAi。冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）摄入表达有suppressor of actin（Sac1）、leukocyte receptor complex member（lrc）、offtrack（otk）shRNA的酵母，各基因表达量显著下调，幼虫出现高死亡率。shRNA不仅能利用载体进入一些较难转入的细胞系中发挥作用，而且与hpRNA类似，茎环结构使得shRNA更稳定，持效期长。二者都可以通过微生物表达系统大量合成，成本相对较低。同时，shRNA序列设计时能尽可能避开脱靶位点，最大程度减少对非靶标生物的脱靶风险。但是，shRNA在病虫害防治领域的研究还十分有限。
1.1.5 miRNA和其他RNA分子
非编码miRNA长度为17～23 nt，miRNA通过与靶标mRNA的3’UTR区域结合，抑制靶mRNA翻译或促进降解，从而调控基因表达。miRNA的异常表达会使昆虫生长发育受阻或死亡，说明miRNA具有作为RNA农药防治病虫害的潜力。例如，棉花内源性miR166和miR159分别靶向大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）Clp-1和HiC-15，干扰菌丝中2种基因表达，从而抑制大丽轮枝菌的毒力；miR-2703被褐飞虱（Nilaparvata lugens）摄入能导致幼虫死亡，成虫产卵量下降。然而，miRNA农药的研究进程远远落后于dsRNA。此外，还有多种人工合成的RNA分子可以沉默基因表达，有望用于病虫害防治。人工miRNA（artificial microRNA，amiRNA）从miRNA技术发展而来，是在选定的pre-miRNA骨架中将miRNA序列替换为人工设计的目标序列。例如，在烟草中表达针对烟粉虱（Bemicia tabaci）3个关键基因sex lethal protein、acetylcholinesterase和orcokinin的amiRNA，转基因烟草上烟粉虱数量显著减少，若虫发育异常。棉铃虫取食以斜纹夜蛾（Spodoptera litura）内源miRNA（let-7）为骨架靶向ecdysone receptor（EcR）的amiRNA-HaEcR后，死亡率明显升高，繁殖能力降低。RNA microspheres（RMS）是通过滚环转录技术合成的RNA微球，可以快速内化到草地贪夜蛾细胞系Sf9中。RMS靶向东方粘虫CHSA和CHSB基因时，基因干扰效率达88%，死亡率在60%左右。Paperclip dsRNA（pcRNA）是一种新型RNA结构，其特点是部分末端闭合，形成类似纸夹的形状。pcRNA可以通过非Clathrin途径进入埃及伊蚊（Aedes aegypti）细胞触发RNA干扰，而siRNA、shRNA和dsRNA大多是通过Clathrin介导的内吞作用被埃及伊蚊细胞摄取。这些发现为传统基因干扰方法不敏感或具有抗性的病虫害开发防治新技术提供了思路。
1.2 RNA农药的市场化进程
随着RNA杀虫产品的上市，RNA农药开始逐渐走向市场。目前，RNA杀虫产品在病虫害防治方面的应用包括转基因作物和喷洒型dsRNA制剂。
1.2.1 转基因作物RNA农药市场化
转害虫基因dsRNA的作物可追溯到2007年，美国孟山都公司（Monsanto Company）成功地在玉米中表达靶向玉米根萤叶甲（Diabrotica virgifera virgifera）V-ATPase A dsRNA，玉米根萤叶甲幼虫取食这种玉米后生长发育受阻并死亡。10年后，该公司推出了转dsRNA的抗虫玉米产品SmartStax PRO，首次被美国环境保护署（EPA）批准作为杀虫剂使用。这是全球范围内首款获批的RNA杀虫产品。这款产品创新性地将玉米根萤叶甲Snf7 dsRNA堆叠在苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）Cry3Bt1、Cry34/35Ab1蛋白和耐除草剂cp4-epsps的转基因玉米中，进一步提高了抗虫效果，同时延缓了抗药性的产生。玉米根萤叶甲是破坏力最强的玉米害虫之一，被美国农户称为“十亿美元害虫”。其造成了极大的经济损失，开发防治玉米根萤叶甲的产品对农业生产具有重大意义。SmartStax PRO上市后在多个国家获得种植许可，2021年1月该产品获得中国农业农村部颁发的转基因生物安全证书（进口和食品/饲料用途），进一步加速了该产品在全球的商业化进程。
1.2.2 喷洒型RNA农药市场化
继转基因农作物的RNA产品市场化后，可喷洒型RNA农药也逐渐走入市场。2019年，拜耳公司向美国EPA提交了防治蜜蜂狄斯瓦螨（Varroa destructor）的RNA产品BioDirect，这是第1个向EPA提交的外源应用RNA农药。2023年12月，全球第1款获美国EPA注册的喷洒型RNA农药Calantha（https://www.greenlightbiosciences.com/calantha-for-cpb）诞生，用于防控抗药性日益严重、对RNAi高度敏感的马铃薯重要检疫害虫——马铃薯甲虫。Calantha由美国绿光生物科学公司（GreenLight Biosciences）研发，含有马铃薯甲虫蛋白酶体β5亚基（PSMB5）dsRNA，能造成甲虫体内自身代谢产物累积而死亡，使用0.8% dsPSMB5制剂处理马铃薯甲虫2龄幼虫，药后6 d致死率高达90%。Calantha田间用量少于10 g/hm2，并能在3 d内完全降解，不会在环境中残留。
Calantha对马铃薯害虫的绿色防控具有重要意义，标志着RNA农药在商业化应用领域取得重大突破，也是生物农药行业新的里程碑。此外，在防治植物病害方面，美国绿光生物科学公司宣布正在积极研发基于RNAi技术防治白粉病和灰霉病的喷雾型产品，预计于2025年作为第1款RNA杀菌剂产品批准上市。该公司的RNA产能已达到500 kg/年，并准备扩大至1,000 kg/年。
1.2.3 国内RNA农药发展现状
2022年，我国将RNA农药列入《“十四·五”全国农药产业发展规划》，并确定为优先发展的农药品种。随着国外RNA农药的快速发展，我国基于RNAi的产品研发和田间试验也取得了显著成果。国内第1家RNA生物农药公司硅羿科技（上海）有限公司于2017年创办，硅羿科技获得国内最早颁发的4张RNA农药“核酸干扰素”命名函，其中烟草花叶病毒核酸干扰素SG-RNA001已正式进入农药登记测试阶段，该公司研发的防治核盘菌RNA杀菌剂正处在田间试验阶段。2020年成立的上海植生优谷生物技术有限公司，其RNA产品对黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata）、棉蚜（Aphis gossypii）等害虫的防治效果十分显著。我国RNA农药企业方兴未艾，RNA产品逐步崭露头角，具有巨大市场潜力。可以预计，RNA农药在不久的将来会迎来广阔的应用前景。在更多技术开发和适当政策引导下，我国RNA农药有望实现商业化并赶超国际企业进程。
2 RNA农药创制的瓶颈问题及解决办法
2.1 高效靶基因筛选难度大
RNA农药的作用依赖于关键靶基因的沉默效果。不是任意基因的沉默都能导致有害生物死亡或发育停滞，只有关键基因对有害生物的生存或繁殖具有决定性作用，而高效筛选出关键基因存在困难。（1）很多发育关键基因在昆虫胚胎时期表达，很难有高效的基因干扰手段干扰胚胎时期基因的表达。同时，昆虫龄期越高，靶基因越难干扰，基因筛选难度越大。（2）许多基因存在功能冗余或代偿机制，可能导致单个基因沉默后无法使有害生物死亡。（3）一些非模式生物的基因组注释不足，增加了筛选靶点的难度。（4）传统筛选依赖试验验证，耗时耗力。尽管高通量测序和人工智能（AI）算法已开始应用，但靶点预测的准确性与通量仍需提升。（5）许多功能保守的基因是生物生存必须的，如actin，但是由于序列保守性高，存在脱靶风险，不宜用作RNA防治靶点。以上种种问题都表明，高效靶基因的筛选是研发RNA农药的核心挑战，推动RNA农药应用，需突破基因功能研究、数据分析与生态安全等多重制约。
2.2 物种间基因干扰效率差异大
RNA干扰效率在不同昆虫中存在明显差异。在鞘翅目（Coleoptera）拟步甲科（Tenebrionidae）、叶甲科（Chrysomelidae）等甲虫中，RNA干扰效果显著且具有系统性。目前市面上已有的2种RNA产品都针对鞘翅目害虫。在蜚蠊目（Blattaria）德国小蠊（Blattella germanica）、直翅目（Orthoptera）东亚飞蝗（Locusta migratoria）等昆虫中，注射dsRNA可以诱导高效的RNA干扰。相比之下，鳞翅目（Lepidoptera）昆虫的RNAi效果不稳定且效率低。即使在同一目中，不同昆虫的基因干扰效率也存在差异，例如鳞翅目昆虫烟草天蛾（Manduca sexta）RNA干扰效率明显高于家蚕。同时，在昆虫的不同组织和发育阶段，干扰效率也不同，通常低龄幼虫比高龄幼虫和成虫的基因干扰效率高。
核糖核酸酶对dsRNA的降解是导致RNA干扰效率低的主要原因之一。鳞翅目昆虫存在特异性表达的核酸酶REase，核酸酶的活性比马铃薯甲虫高。昆虫肠道和血淋巴中的核酸酶会降解dsRNA，在RNA对昆虫造成危害之前将其破坏。其次，dsRNA在一些昆虫细胞内运输效率低。dsRNA进入细胞依赖细胞主动内吞作用等途径，进入细胞后需从酸化内体中释放触发RNAi，运输到细胞质中的作用位点。赤拟谷盗（Tribolium castaneum）细胞内dsRNA能够高效运输到细胞质中并转化为siRNA。相比之下，草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞内dsRNA的运输效率低下，内体释放机制缺陷，dsRNA滞留在早期内体和晚期内体中，无法逃逸到细胞质，不能转化为siRNA。此外，不同昆虫RNAi机制相关基因的表达存在差异。参与dsRNA加工成siRNA的RNA结合蛋白Staufen C仅在鞘翅目昆虫中检测到，未在其他昆虫中发现。系统性RNAi依赖跨膜蛋白Systemic RNA interference deficient-1（Sid-1），Sid-1帮助RNA在不同细胞和组织间传播，不同昆虫Sid-1蛋白含量不同可能会导致RNA干扰效率的差异。R2D2蛋白辅助Dicer酶将dsRNA剪切成siRNA并装载到RISC中，而家蚕缺乏R2D2可能是家蚕卵巢细胞对RNAi不敏感的原因之一。昆虫体内Argonaute蛋白存在差异，鞘翅目昆虫含有丰富的Argonaute2，但在家蚕中过表达Argonaute2能诱导高效的RNAi。Argonaute2可能是影响鳞翅目昆虫RNAi效率的因素之一。昆虫体内的生理条件也会影响RNAi效率，如鞘翅目昆虫（马铃薯甲虫）肠道环境温和碱性低，而鳞翅目昆虫中肠为强碱性，RNA容易水解。
纳米颗粒包装RNA是一个可行的解决方案，帮助RNA在效率低的昆虫体内发挥作用。这部分内容将在下面一节中详细介绍。
2.3 裸露RNA稳定性差
对于喷洒型RNA农药而言，RNA分子的稳定性是决定其能否高效防治的关键原因之一。生物体内环境会影响RNA的稳定性，例如，昆虫的唾液、中肠液、血淋巴均会降解dsRNA，使dsRNA在体内造成极大损失，影响基因干扰效率。许多RNA制剂在室内生测试验中造成较高死亡率，但应用于田间，效果大打折扣，这是由于外界环境会影响dsRNA的稳定性。环境中的核糖核酸酶存在于微生物、皮肤、唾液等生物样本中，核酸酶会降解dsRNA。紫外线照射或高温下，dsRNA会被逐渐降解。根部灌溉施用的dsRNA由于与土壤颗粒和微生物相互作用，在土壤中作用发挥不稳定。在模拟降雨条件下，叶面喷施Cy3标记的dsRNA-CMV2b很容易被流水从叶片上冲走。
纳米颗粒包装RNA可以显著减少核酸酶、血淋巴、中肠液对RNA农药的降解，并且诱发溶酶体逃逸、高效释放到细胞质中，帮助RNA在昆虫体内更好地发挥作用。目前，市面上已经开发了多款纳米颗粒，提高dsRNA的稳定性。首次利用纳米载体在昆虫体内递送dsRNA的案例是壳聚糖（chitosan）结合冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）AgCHS1和AgCHS2 dsRNA，抑制几丁质合成酶基因的表达。近年来，星形阳离子聚合物（star polycation，SPc）能与核酸分子通过静电、氢键等分子间作用力结合形成复合物，保护核酸免受昆虫血淋巴、中肠液中核酸酶的降解，使更多的dsRNA安全到达靶标组织。利用SPc递送玉米螟（Ostrinia furnacalis）神经肽F受体（NPFR）和AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）dsRNA能提高dsRNA的稳定性和给药能力，对玉米螟幼虫田间防效达84%。无毒可降解的层状双氢氧化物（layered double hydroxide）修饰的新型纳米黏土（clay nanosheets）能装载dsRNA抵御植物病毒感染，复合物耐水冲刷，喷洒后30 d仍能在叶片上检测到。功能化后呈正电荷的碳点（carbon dot）可以通过静电作用与带负电的dsRNA结合，保护dsRNA在光照、高温和外源核酸酶处理下不被降解，延长dsRNA的稳定期。树枝状阳离子聚合物由于表面具有大量带正电荷的胺类官能团，可以与带负电的dsRNA/siRNA结合成复合体，增强核酸分子稳定性。大肠杆菌来源的无核小细胞（minicell）能包裹dsRNA形成ME-dsRNA，ME-dsRNA能保护dsRNA免受核酸酶降解，稳定在草莓表面，ME-dsRNA靶向灰霉病菌Chs3a、Chs3b、DCL1、DCL2，显著抑制真菌生长。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）能将dsRNA包裹在脂质双层中，在昆虫中肠碱性环境下防止dsRNA过早释放，进入靶细胞酸性环境后加速释放。LNPs/dsRNA细胞转染效率高达96.4%，当LNPs/dsRNA占裸露dsRNA质量分数为25%时，基因干扰效率达91.7%。
此外，还有一些提升核酸分子稳定性的方法。例如，对siRNA进行硫代磷酸化或甲基化的化学修饰，增加稳定性。硅羿科技公司通过AI算法优化RNA序列，开发出抗降解的“错配间隔”设计，显著延长核酸分子环境持效期。改进制剂工艺，例如添加紫外线吸收剂、成膜剂或黏附剂等辅助成分，可减少环境因素对RNA的破坏。AgroSpheres公司开发的生物颗粒封装技术，使dsRNA在田间条件下的半衰期延长至7 d。裸露的RNA稳定性差是RNA农药商业化的重要瓶颈，通过纳米技术、化学修饰与递送系统创新等措施，可逐步突破这一限制。
2.4 RNA进入生物体内效率低
生物体存在自然屏障，阻碍外源物质进入。喷洒型RNA产品喷洒在植物叶片表面，叶片绒毛、气孔和蜡质等会造成药物与叶面的接触角增大，不利于叶片吸收。病原菌细胞壁等屏障会阻碍RNA分子的穿透，例如疫霉菌（Phytophthora infestans）无法直接吸收裸露的dsRNA。昆虫体壁会显著降低RNA递送效率，昆虫围食膜同样也会阻碍dsRNA进入肠道，昆虫肠上皮细胞还能与dsRNA产生静电排斥，导致RNA递送困难。RNA需要克服这些屏障，才能顺利进入生物体内发挥作用。
纳米载体可以提高RNA进入生物体内的效率。研究发现，纳米载体能帮助RNA穿透植物表皮层在维管束组织中运输，递送进疫霉等真菌细胞内，突破草地贪夜蛾、绿盲蝽（Apolygus lucorum）、棉蚜（Aphis gossypii）等昆虫体壁进入虫体。纳米载体在提高dsRNA递送效率的同时，还能增加植物体的内吸作用。当dsRNA进入细胞后，纳米颗粒通过“质子海绵效应”等机制，确保dsRNA从纳米载体中释放，提升细胞递送效率。因此，纳米颗粒显著提升了RNA干扰效率，提高了害虫死亡率。如瓜蚜syn dsRNA干扰效率提高50%，致死率从38%提升至63%。
真菌、共生菌和病毒等作为RNA递送媒介，可以利用其特异性定殖或侵染能力，高效递送靶基因RNA。绿僵菌（Metarhizium acridum）中表达针对东亚飞蝗F1F0-ATPase subunit的dsRNA，转基因菌株表现出野生型菌株3.7倍的高毒力，有效提高了飞蝗死亡率。共生菌介导的RNA干扰（SMR）通过共生菌在昆虫宿主中连续合成dsRNA实现。转基因细菌被昆虫摄入后，能在昆虫体内定殖，持续介导系统性RNAi，并可以水平传播给其他个体。例如，改造西花蓟马（Frankliniella occidentalis）中的共生菌，得到RNaseⅢ缺失同时表达vitellogenin dsRNA的菌株，菌株被幼虫摄入后成功实现基因干扰并影响成虫繁殖力。病毒介导的RNA干扰（VMR）是通过病毒感染宿主细胞，在复制过程中表达靶基因的dsRNA，进而触发RNAi，抑制基因表达。例如，Flock House病毒（FHV）能够感染多种蚜虫，工程化的FHV DI-634能触发蚜虫RNAi，导致蚜虫死亡。
2.5 RNA农药应用成本高
目前RNA的合成方式主要包括体外合成和微生物发酵合成。依赖T7 RNA聚合酶体外合成策略合成的dsRNA纯度高。但聚合酶合成具有一定难度，采用商品化试剂盒价格昂贵，只适用于实验室小规模研究，无法满足田间应用的需求。微生物发酵体系是极具潜力的合成策略，在获得大量dsRNA产品的同时降低了生产成本。但是，合成的RNA不能直接分泌到细胞外且内毒素含量较高，需要裂解、提取和纯化，过程繁琐。同时，通过微生物发酵体系生产的dsRNA产量相对较低。这些因素导致RNA农药体外合成成本高。此外，dsRNA在环境中易降解，实际应用中可能需多次施药，间接增加了成本。植物表皮屏障和害虫体壁结构限制了dsRNA的递送效率，进一步提高了有效剂量需求。
为了解决成本问题，一批优势集中的新兴生物农药企业和研发单位将dsRNA的生产成本从2008年的12,000美元/g降至2021年的1美元/g。其中，Renaissance BioScience公司建立了以酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵生产dsRNA的平台，通过在酵母中表达针对不同物种靶标基因的dsRNA用于害虫防控。绿光生物开发的无细胞平台在dsRNA生产中有着巨大的优势，公司以含有RNA的低成本聚合物（如酵母）为原料，从原料中将RNA分解成核苷单磷酸（NMP）单元，随后利用自主开发的酶体系、DNA模板和廉价能量源，将这些基础单元重新组装成目标RNA产物，产品成本已低至0.5美元/g。此外，RNase Ⅲ缺陷型大肠杆菌菌株HT115（DE3）和L4440质粒被广泛用于hpRNA的生产，可以极大降低合成成本。利用基因编辑和同源重组技术改造大肠杆菌建立的一种新的大肠杆菌表达系统pET28-BL21（DE3）RNaseⅢ，产量是传统HT115（DE3）大肠杆菌表达系统的3倍以上，显著降低了生产成本，为RNA制剂在田间的实际应用提供了可能。研究表明，除大肠杆菌和酵母，更多的微生物底盘包括枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等，改造后的菌株均可用于提高RNA产量，降低成本。
现有的微生物表达系统大多需要异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）来诱导RNA表达，但IPTG成本较高，其毒性也可能成为RNA规模化生产的障碍，因此研究者们相继开发了多种诱导方法。例如，利用大肠杆菌组成型启动子proD合成dsRNA不需要任何诱导剂，当T7和proD启动子串联时，dsRNA产量提高。一种高产的表达培养基产生的dsRNA比使用1 mmol/L IPTG诱导的高15倍。随着技术的不断进步和研发投入，相信会有更多经济实惠的RNA生产方法，降低RNA农药的应用成本。
3 RNA农药展望
随着RNA干扰技术的快速发展，RNA农药作为一种新兴的绿色防控手段，展现出巨大潜力。然而，RNA农药目前仍面临高效靶基因筛选难度大、物种间基因干扰效率差异大、裸露RNA稳定性差、RNA递送效率低、RNA农药应用成本高等瓶颈问题。为实现RNA农药商业化应用，需从靶标筛选、稳定性优化、递送系统及产业化生产等方向进行系统性突破。
靶基因的选择直接决定RNA农药的特异性和有效性。通过机器学习模型分析基因序列的二级结构、GC含量等预测高效干扰位点，筛选每个靶基因中的最优干扰区域。研究者开发了一款名为dsRNA Engineer（https://dsrna-engineer.cn）的工具，工具拥有筛选靶标、定向靶标、脱靶和多重靶标4项功能，帮助用户设计针对害虫的dsRNA。针对重大农业害虫（如鳞翅目、鞘翅目），建立涵盖致死dsRNA、发育相关基因及抗性相关基因的高通量筛选平台，并通过试验验证基因功能，确保靶标有效性。dsRNA的非特异性沉默可能危害非靶标生物，开发基于深度学习的算法，整合物种间同源基因比对与脱靶效应数据库，排除潜在脱靶序列。同时，推广siRNA、miRNA及shRNA等短链RNA的使用，通过化学修饰增强其稳定性并减少脱靶风险。当前RNA农药研究集中于杀虫剂，RNA除草剂开发仍处于起步阶段。除草剂未来需聚焦植物靶标筛选，选择杂草特有基因和关键代谢通路基因，避免对作物的干扰。
RNA分子易被环境降解且难以穿透生物屏障，开发高效递送系统是提升田间效果的核心。开发与现有农药制剂兼容的“农药伴侣”型纳米载体，通过物理吸附或化学偶联实现dsRNA与常规药剂的便捷复配。例如，基于阳离子聚合物（如壳聚糖、SPc）或脂质体的纳米颗粒，可在田间直接与化学农药桶混使用，降低应用成本。其次，通过自组装、微胶囊化等技术将dsRNA直接制备成纳米级制剂，利用载体与昆虫体表或植物细胞壁间的分子作用增强穿透效率。此外，设计响应型纳米载体（如pH敏感型、酶触发型），在1 h内快速穿透害虫体壁或植物表皮。基于碳量子点的纳米载体可借助光热效应加速昆虫体壁通透性，为dsRNA的瞬时递送提供新思路。
构建多维度增效体系，克服环境因素对RNA农药的负面影响。针对同一害虫的不同生理通路（如几丁质合成基因CHS和能量代谢基因ATPase）设计多靶点dsRNA混合物，或开发广谱性制剂，延缓抗药性产生。化学农药与RNA农药的联合应用可兼顾速效性与持效性，协同增效，减量控害。例如，利用纳米材料同时负载dsRNA与低剂量化学农药，介孔二氧化硅RHMS/吡虫啉/dsCYP6CY13复合物对棉蚜的毒力较单剂提升1.95倍，化学药剂用量减少50%。应用SPc自组装纳米平台，同时递送氯虫苯甲酰胺和草地贪夜蛾Nrf2的dsRNA，氯虫苯甲酰胺/SPc/dsNrf2复合物对草地贪夜蛾的活性显著提高，归一化协同比为5.43～6.25。设计dsRNA与植物源农药的复配方案，既可加速害虫死亡，又能延长防控窗口期。例如，针对桃蚜的多元纳米生物制剂苦参碱/SPc/dshem能克服RNA农药持效期短、植物源农药速效性差的问题，田间综合防效高达90%。
RNA农药的产业化之路仍面临技术、成本与法规的多重挑战。未来通过跨学科合作，融合纳米技术、合成生物学与智能设计，推动RNA农药从实验室走向田间，为生物农药跨代发展提供核心驱动力。
